核酸提取，說則簡單，實則更簡單。但即使是"入門級”的實驗，在操作過程中難免也會出現(xiàn)各種各樣的Bugs。高質(zhì)量的核酸是下游PCR/qPCR、重組載體、cDNA文庫構(gòu)建等相關(guān)實驗成敗的關(guān)鍵。尤其是RNA提取，一頓操作猛如虎，定量結(jié)果想吃土.....

耽誤大家兩分鐘，看完這篇文章再干飯，小M讓你少禿點。

著有“玄學(xué)”之稱的分子生物學(xué)，師兄師姐說小M要做的都是“升級打怪入門級”的實驗，然而，實驗記錄本上清晰地羅列著自己整理的堪稱完美的(假裝看懂的Steps)實驗流程,可是完美的流程下，總是充斥著不絲滑的操作--

提 DNA，PCR，電泳，純化回收，構(gòu)載體；提 RNA，反轉(zhuǎn)錄，文庫構(gòu)建，qPCR……如何快速完成一套絕美的逆襲?。。?/span>

完美操作第一步

打好科研“地基”從核酸提取開始

核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是分子生物學(xué)研究的主要對象。如果要對核酸的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，首先就要對核酸進(jìn)行提取和純化。

核酸提取是個啥？字面意思，就是把核酸從樣本中提取出來唄！

那一般常見的提取方法有哪些呢？

表 1.核酸提取的常見方法

提取步驟

核酸提取主要包括細(xì)胞裂解、核酸吸附、雜質(zhì)漂洗和核酸洗脫四步。

那具體到實驗中，我們該選擇哪種提取方法呢？這就要看個人的實驗設(shè)計方案及實驗組的經(jīng)費情況啦！

磁珠法提取效果當(dāng)然很好，但貴是真的貴，而且還得購買配套的磁力架，批量提取的話，還是不太建議的！自配試劑的優(yōu)缺點是顯而易見的，若后續(xù)實驗對核酸要求不高 (如常規(guī)的 DNA 提取，后續(xù)用做普通 PCR 擴(kuò)增)，這種提取方法也可選擇。

但如果對核酸的質(zhì)量要求比較高 (如定量或文庫構(gòu)建等。尤其不能忽略的是 RNA 提取中的降解和純度問題)，小 M 還是比較推薦受眾度較高的離心柱法；至于質(zhì)粒提取，考慮到純度與濃度，肯定也選擇這種性價比較高的離心柱法啦！

圖 1. 離心柱法核酸提取流程圖

來來來，排隊隊，順帶開啟 Kits 介紹模式……

MCE 新推出三款核酸提取純化試劑盒，均利用硅膠膜離心柱對核酸進(jìn)行特異性吸附，改良的裂解液可以促進(jìn)細(xì)胞充分裂解、蛋白變性、核酸釋放；改良的吸附緩沖液能有效地促進(jìn)核酸結(jié)合到硅膠膜上；Z后經(jīng)過洗脫即可獲得高純度核酸。

Kit one (基因組 DNA 小量抽提試劑盒)：我適用于從動物組織/細(xì)胞、酵母、大腸桿菌等樣本中有效提取并純化基因組 DNA，內(nèi)含蛋白酶 K 可去除蛋白污染，經(jīng)純化的基因組 DNA 后續(xù)可用于 PCR、qPCR、酶切、Southern Blot 等實驗。

Kit two (病毒 DNA/RNA 抽提試劑盒)：我適用于從血漿、血清、全血、組織勻漿液、痰液、動物細(xì)胞上清等中提取病毒 DNA/RNA。我不僅包含 蛋白酶 K，更有核酸助沉劑助力，提取的核酸那可不團(tuán)團(tuán)來嘛！純化的病毒 DNA/RNA 可用于 PCR、RT-PCR、qPCR 等實驗。

Kit three (質(zhì)粒大量抽提試劑盒)：我適用于從 ≤500 mL LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞中高效的提取質(zhì)粒 DNA。RNase A 可對 RNA 進(jìn)行清chu，柱上去除內(nèi)du素，Very good!

MCE 新上線核酸提取試劑盒 (離心柱型)

產(chǎn)品名稱

Genomic DNA Mini Purification Kit

Viral DNA/RNA Mini Purification Kit

Plasmid DNA Maxi Purification Kit

完美操作第二步

避開操作“雷區(qū)”，拿到高純度核酸

小M：Protocol 很完美，實際操作過程中，也難免會遇到各種小問題。

下面小 M 對 RNA 提取過程中常見問題進(jìn)行了一一盤點。

(此處主要針對 RNA 提取，文末彩蛋有 DNA 和質(zhì)粒提取注意事項匯總哦)。

RNA 提取后續(xù)試驗主要包括 PCR、RT-PCR、qPCR、cDNA 文庫構(gòu)建等，RNA 沒提好，后面的實驗問題也是連貫性的，一個不小心可就都 game over 了。這個 RNA 提取，真的是……腦殼疼！

來來來，這道題，我們重點講一下。

影響 RNA 得率低的因素很多？

抽提 RNA，當(dāng)然要做到 “三從四德”。

一從：外源酶污染？NO！

二從：內(nèi)源酶活性？NO！

三從：抽提目的性？YES！

一德：使用無 RNase 耗材，選擇合適的操作環(huán)境。

二德：確定樣本后選擇合適的裂解液，樣本與裂解程度不匹配，抽提結(jié)果也會大打折扣。

三德：裂解、勻漿、抽提、洗脫——快！準(zhǔn)！狠！

四德：衡量抽提性價比的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實驗的結(jié)果，得率不是唯1標(biāo)準(zhǔn)。即我們需要明確下一步的實驗，如果是 PCR，其實驗本身對 RNA 的質(zhì)量要求沒有那么高，而 qPCR 對 RNA 的要求相對又高點，但如果要做 cDNA 文庫構(gòu)建，其對 RNA 的要求就很高了，因此 RNA 質(zhì)量便是 “經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)” 了，頗有 “一損俱損” 的感覺了。

小白: “三從四德” 我也懂，但 RNA 得率這么低具體是為什么呢？

小M：還不是因為 RNA 太嬌貴，放太久會降解，環(huán)境不干凈會降解，吹口氣也能降解~

彩蛋時間?。?！

(含DNA和質(zhì)粒提取注意事項）

相關(guān)產(chǎn)品

2× PCR Master Mix (with Dye)

高效、快速的 2× 濃度的即用型預(yù)混液（含溴酚藍(lán)），含有常規(guī) PCR 反應(yīng)所需的所有組分（樣品 DNA，引物和水除外）

2× Fast PCR Master Mix (with Dye)

用于快速 PCR 擴(kuò)增的 2× 濃度的即用型預(yù)混液（含溴酚藍(lán)），含有除樣品 DNA、引物和水外的所有 PCR 成分。

2× High-Fidelity PCR Master Mix

新型高保真高效率的即用型 PCR 擴(kuò)增預(yù)混液，適用于高難度長片段的 PCR 擴(kuò)增實驗。

RT Master Mix for qPCR II

采用升級款反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)更高效、快速，適用于高 GC 含量、復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)、少量 RNA 模板等。即用型預(yù)混液，一步操作即可完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，簡便、快捷。

RT Master Mix for qPCR II (gDNA digester plus)

反轉(zhuǎn)錄即用型預(yù)混液，采用升級款反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)更高效、快速，適用于高 GC 含量、復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)、少量 RNA 模板等。試劑盒配有 gDNA digester 可去除 RNA 模板中的基因組 DNA 污染。

SYBR Green qPCR Master Mix

2× 濃度的即用型預(yù)混液，含有 qPCR 的所有組分，只需加入樣品 DNA，引物和水即可快速高效完成 qPCR 反應(yīng)。

MCE SYBR Green qPCR Master Mix (Universal)

適用于所有 qPCR 儀的 2× 濃度即用型預(yù)混液。采用新型抗體法熱啟動 DNA 聚合酶，配合 PCR 反應(yīng)促進(jìn)因子及比例優(yōu)化的 Buffer 體系，實現(xiàn)高特異性、高靈敏度的 qPCR 檢測。

SYBR Green qPCR Master Mix (High/ Low/No ROX)

2× 濃度的即用型預(yù)混液，含有 qPCR 的所有組分， 只需加入樣品 DNA，引物和水即可快速高效完成 qPCR 反應(yīng)。

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