細(xì)胞培養(yǎng)攻略——HK-2

HK-2細(xì)胞屬源于正常腎的近曲小管細(xì)胞，通過導(dǎo)入HPV-16 E6/E7基因而獲得永生化。將含有HPV-16 E6/E7基因的重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN 16 E6/E7轉(zhuǎn)染外生包裝細(xì)胞Psi-2；Psi-2細(xì)胞產(chǎn)生的病毒再去感染兼嗜性包裝細(xì)胞系PA317，最后將PA317細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒導(dǎo)入正常的腎皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞。盡管pLXSN 16 E6/E7中含有新霉素抗性，但未用G418篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)克隆。Southern和FISH分析顯示，HK-2細(xì)胞來源于單克隆。PCR檢測證實(shí)，HK-2細(xì)胞基因組中含有E6/E7基因。

常見問題

1、出現(xiàn)拉絲

細(xì)胞伸出細(xì)長的絲有兩種情況：

第一種情況是細(xì)胞遷移造成的，細(xì)胞在培養(yǎng)皿上并不是靜態(tài)的，也會出現(xiàn)遷移。遷移時細(xì)胞的一部分滯留在原處，遷移的過程中會拉出一條細(xì)長的絲。這種情況下拉絲的細(xì)胞占少數(shù)，細(xì)胞整體的生長狀態(tài)是正常的，不用特殊處理。

第二種情況是營養(yǎng)不良，拉絲的細(xì)胞占大多數(shù)，同時細(xì)胞生長緩慢，此時可以提高血清比例（不超過20%）或添加5 ng/mL EGF。

2、形態(tài)發(fā)生變化

正常的HK-2呈鋪路石狀生長，如果細(xì)胞呈鐮刀狀或不規(guī)則狀（如下圖），可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)環(huán)境發(fā)生了較大的改變，比如從有血清到無血清的轉(zhuǎn)換，此時換回原來的培養(yǎng)條件細(xì)胞可逐漸恢復(fù)；如果細(xì)胞變得細(xì)長，這時候可能是營養(yǎng)不良。

3、生長緩慢

在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件RPMI-1640+10% FBS+1% P/S，以及1：3傳代條件下，HK-2的傳代周期約為3天；

當(dāng)細(xì)胞生長緩慢，一周無法傳代時，需要考慮培養(yǎng)基特別是血清是否合適；

選擇合適的培養(yǎng)基及血清，同時加大細(xì)胞接種密度可以改善；

血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞狀態(tài)變化，建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。

4、出現(xiàn)空泡

空泡問題需要結(jié)合生長速度和形態(tài)來看：如果生長速度和形態(tài)正常，空泡可能是正常的細(xì)胞活動，傳代后空泡即可減輕。

如果生長較慢，形態(tài)異常，空泡可能是自噬行為，可加大血清比例（不超過20%）或更換血清品牌改善細(xì)胞狀態(tài)。

培養(yǎng)基選擇：

HK-2最初建系使用無血清培養(yǎng)，眾多文獻(xiàn)以及實(shí)踐證明MEM、DMEM或DMEM/F12添加10%胎牛血清的條件下，HK-2也能良好生長。但胎牛血清的質(zhì)量是關(guān)鍵，胎牛血清品質(zhì)越高，HK-2狀態(tài)越好。

若使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，需要使用多聚賴氨酸或者明膠包被培養(yǎng)瓶，以促使貼壁。

【細(xì)胞復(fù)蘇】

1、取出1mL凍存管后，迅速放入37℃水浴鍋中不斷搖晃使其解凍，直至凍存管中無結(jié)晶（此過程盡量在2min內(nèi)完成）；

2、準(zhǔn)備15mL離心管，加入2-6mL完培，將凍存管中的細(xì)胞懸液移至離心管，1000 rpm離心3~5min；（比較難養(yǎng)的細(xì)胞可適量增加離心管中的完培）

3、吸棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至無菌的培養(yǎng)器皿中，輕晃動混勻后放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注：復(fù)蘇第二天若細(xì)胞狀態(tài)較好，但漂浮碎片較多可做換液處理；

復(fù)蘇的細(xì)胞需要時間恢復(fù)狀態(tài)，當(dāng)復(fù)蘇好后密度低于80%時，2天內(nèi)暫時不要換液，細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)后再進(jìn)行后續(xù)傳代等操作；

【細(xì)胞傳代】

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%，即可傳代培養(yǎng)。

收集細(xì)胞：貼壁細(xì)胞可以參考以下方法

1、吸去培養(yǎng)液，加入不含鈣鎂的PBS，輕輕潤洗瓶底1-2次，吸棄PBS；

2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），鋪勻瓶底放入培養(yǎng)箱中消化1-2min；（部分細(xì)胞貼壁較牢，可采用分步消化：將消化下來的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管終止，在培養(yǎng)瓶中加入胰酶繼續(xù)消化，直至大部分細(xì)胞脫落）

3、倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞變圓脫落，迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化，完培與胰酶比例為2:1；

4、輕輕吹打細(xì)胞后吸出轉(zhuǎn)移至離心管中。半貼壁半懸浮細(xì)胞需先收集懸液至離心管再參考貼壁細(xì)胞操作。

離心：收集好的細(xì)胞在1000rpm條件下離心3~5min，離心好后棄除上清液。

接種：準(zhǔn)備好新的培養(yǎng)瓶并添加適量完全培養(yǎng)基，在離心管加入1-2mL完全培養(yǎng)基重懸吹打均勻，初次傳代將細(xì)胞懸液按1:2比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，后續(xù)可根據(jù)細(xì)胞實(shí)際情況按1:2-1:4的比例傳代；接種完成后放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

懸浮細(xì)胞建議采用半換液傳代：將培養(yǎng)瓶站立靜置5-10min，肉眼可見細(xì)胞沉底，吸取1/2~2/3上清至離心管離心，將瓶內(nèi)剩余懸液按1:2或1:3的比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，將離心管中的細(xì)胞重懸后放入培養(yǎng)瓶添加新鮮完全培養(yǎng)基即可。

【細(xì)胞凍存】

收集細(xì)胞參考細(xì)胞傳代步驟。

凍存液重懸：細(xì)胞按照傳代步驟收集細(xì)胞至離心管并計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)的密度決定細(xì)胞凍存數(shù)量，一般推薦細(xì)胞凍存密度為1×106-1×107個活細(xì)胞/管。離心后棄上清，加入配制好的凍存液重懸，分配到凍存管中，每管1mL。

凍存：將凍存管放入程序降溫盒中進(jìn)行梯度降溫，然后放入-80℃冰箱降溫，24h后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐中。若沒有凍存盒，可于冰箱4℃放置30min，隨后轉(zhuǎn)移至-20℃冷凍2h，接下來將其放于-80℃超低溫冰箱中過夜，最終放置于液氮中以長期保存。