雙抗性TOPO載體的設(shè)計(jì)缺點(diǎn)遠(yuǎn)大于優(yōu)點(diǎn)

Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體的歷史

20年前，市場(chǎng)上第一代商品化topo載體是invitrogen購(gòu)買(mǎi)了專(zhuān)利license開(kāi)發(fā)的，其中最著名的topo載體pCR 2.1-TOPO，這是雙抗性的topo載體。在中國(guó)TA克隆市場(chǎng)占有率極高的是Promega的pGEM T載體和Takara的pMD 18 T載體，這些載體采用傳統(tǒng)T4連接酶連接，全部是Amp單抗性。從理論上說(shuō)， Topo異構(gòu)酶原理的TOPO載體并沒(méi)有要求在技術(shù)上必須做成雙抗性的才能使用。完全可以做單抗性的TOPO載體。市場(chǎng)上目前絕大部分的載體都是單抗性的， 就已經(jīng)說(shuō)明，雙抗性只是在一個(gè)很狹窄的范圍內(nèi)有少量需求，甚至很多同學(xué)在做克隆連接的時(shí)候就沒(méi)有碰到過(guò)要雙抗性的情況

1.為什么invitrogen當(dāng)時(shí)設(shè)計(jì)Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體？

做為普通的PCR產(chǎn)物克隆載體，是完全用不到雙抗性的，既往幾乎所有廠家的T載體/平末端克隆載體，都是單抗性的（雙抗性完全沒(méi)有技術(shù)門(mén)檻，只要在質(zhì)粒里面添加一個(gè)卡那抗性基因就可以）。但是為什么invitrogen特立獨(dú)行設(shè)計(jì)雙抗性TOPO載體呢？ 推測(cè)原因可能是invitrogen的載體系統(tǒng)很多，其中著名的gateway系統(tǒng)里面有很多載體是Amp抗性和kana抗性的?？赡転榱朔奖阍谶@個(gè)系統(tǒng)中通用，所以設(shè)計(jì)了雙抗性。只是適合自身情況才設(shè)計(jì)的。

下圖為invitrogen的雙抗性設(shè)計(jì)的載體

2. Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體的缺點(diǎn)

雙抗性設(shè)計(jì)，增加插入了卡納抗性序列，載體大小至少增加了1kb左右，造成兩個(gè)缺點(diǎn)：

（1）載體可連接片段更短

TOPO載體和傳統(tǒng)TA克隆載體不同，載體與可容納的插入片段是成反比的。雙抗性TOPO載體比單抗性TOPO載體大了一倍多，大的載體能容納連接的片段比小的載體短一些。也就是說(shuō)單抗性載體能連接更長(zhǎng)的片段。

（2）轉(zhuǎn)化子數(shù)量效率更低

連接完的質(zhì)粒，要轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒大小和轉(zhuǎn)化效率成反比，而且是指數(shù)級(jí)的反比，也就是越小的片段越容易轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率大大高于大質(zhì)粒。

3.卡那Kana抗性的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

（1）優(yōu)點(diǎn)：卡納抗性一般不會(huì)長(zhǎng)衛(wèi)星菌落

Amp抗性生長(zhǎng)久了， 容易長(zhǎng)衛(wèi)星菌落， 但是只要控制時(shí)間， 及時(shí)把生長(zhǎng)好的板子放進(jìn)4度冰箱保存，就可以避免這個(gè)問(wèn)題

（2）缺點(diǎn)：復(fù)蘇時(shí)間比Amp抗性復(fù)蘇要長(zhǎng)1個(gè)小時(shí)

轉(zhuǎn)化后，卡那Kana抗性至少需要復(fù)蘇1個(gè)小時(shí)，Amp抗性最快可以不復(fù)蘇（不用做加LB培養(yǎng)液的復(fù)蘇步驟）

4.Aidlab：新一代TOPO載體技術(shù)的首創(chuàng)者和leader

1.采用了Amp氨芐單抗性設(shè)計(jì)

去掉Kana卡那抗性序列，縮短了1kb，全長(zhǎng)基本就是復(fù)制子+Amp抗性，綜合起來(lái)全長(zhǎng)僅1.85kb。是目前國(guó)內(nèi)最小的TOPO載體。

2.Aidlab的TOPO載體能連接的片段更長(zhǎng)，同等條件下，連接效率轉(zhuǎn)化子數(shù)量是一般公司的10-100倍

3.復(fù)蘇時(shí)間可以短到0分鐘

11年前Aidlab的 TOPO克隆載體技術(shù)早已處于領(lǐng)先水平，Aidlab的新一代單抗性TOPO載體任何一個(gè)指標(biāo)都遠(yuǎn)超對(duì)手！