提到ELISA實(shí)驗(yàn)，相信大家都非常熟悉。盡管ELISA實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但在實(shí)驗(yàn)中總會(huì)遇到或多或少的問(wèn)題，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)進(jìn)展受阻，給實(shí)驗(yàn)者帶來(lái)不少困擾。那么給大家介紹一下ELISA實(shí)驗(yàn)影響因素，希望能夠?yàn)槟腅LISA實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行保駕護(hù)航。

1、樣本因素

內(nèi)源性影響因素

大約40%的人血清樣本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和異嗜性抗體等其他物質(zhì)等。以類(lèi)風(fēng)濕因子和補(bǔ)體為例。

類(lèi)風(fēng)濕因子

在類(lèi)風(fēng)濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)，其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)，因?yàn)樵贓LISA測(cè)定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

補(bǔ)體

在固相酶免疫測(cè)定中，來(lái)自哺乳動(dòng)物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有ji活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過(guò)程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái)，使C1q成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來(lái)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另一方面，固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。

外源性影響因素

樣本溶血

溶血樣本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)性，這是由于溶血樣本中含有大量過(guò)氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過(guò)程中往往難以完全洗脫，它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽(yáng)性。所以嚴(yán)重溶血樣本不推薦使用。

樣本受細(xì)菌污染

因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的樣本同溶血樣本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而出現(xiàn)假陽(yáng)性而干擾測(cè)定結(jié)果。

樣本保存不當(dāng)

樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能因蛋白降解或變性而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的樣本宜為新鮮采集。如不能立即測(cè)定，1周內(nèi)測(cè)定的樣本可存放于4℃，1周后測(cè)定的樣本應(yīng)分裝低溫凍存。樣本推薦按使用量分裝以避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融也會(huì)導(dǎo)致蛋白降解或變性。凍存后融解的樣本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。

抗凝劑的干擾

肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性。

樣本脂肪含量過(guò)高

樣本中的脂肪含量過(guò)高，會(huì)干擾抗原抗體反應(yīng)，造成假陰性。通過(guò)冷凍高速離心處理后，高脂樣本會(huì)分層，取樣時(shí)應(yīng)避免吸取上層脂肪層，取中間澄清段進(jìn)行檢測(cè)。

樣本的制備

樣本的收集時(shí)間、處理方法和保存方式都會(huì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。整理了樣本處理方法，供研究者參考。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)（ELISA)常見(jiàn)樣本處理方法

http://www.cloud-clone.cn/topic/201804271043087152.html

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)（ELISA)特殊樣本處理方法

http://www.cloud-clone.cn/topic/201805141347467275.html

2、試劑因素

抗體的純度、親和力、滴度和特異性
抗體是ELISA測(cè)定重要的原料之一，抗體的品質(zhì)決定著ELISA測(cè)定的準(zhǔn)確性。選擇純度高、親和力強(qiáng)及特異性強(qiáng)的抗體，可以有效提高試劑盒的靈敏度和特異性，且能保障檢測(cè)的準(zhǔn)確性。


標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性
標(biāo)準(zhǔn)品定值是定量ELISA測(cè)定關(guān)鍵的因素之一，其中標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性決定了ELISA定量測(cè)定的準(zhǔn)確性。需選用純度高，穩(wěn)定性好的抗原物，并準(zhǔn)確定量，以確保ELISA定量測(cè)定的有效性。


標(biāo)記物的活性
ELISA反應(yīng)中常用到酶標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物等。受檢樣本中靶物質(zhì)的量與固相載體上標(biāo)記物的量呈正比例或反比例關(guān)系，根據(jù)信號(hào)值（酶催化有色產(chǎn)物呈色深淺或熒光信號(hào)）進(jìn)行定性或定量分析。標(biāo)記物的活性，可放大反應(yīng)效果，從而提高ELISA測(cè)定的靈敏度。