細胞培養(yǎng)對科研實驗的影響

一、細胞培養(yǎng)的代次

二、細胞的狀態(tài)、 培養(yǎng)體系

三、細胞的存儲

四、細胞建立庫存 和管理

細胞的代次

l 可連續(xù)培養(yǎng)擴增的細胞系為科學(xué)實驗數(shù)據(jù)提供了可能性；

l 過度傳代會改變細胞系的特性，傳代次數(shù)較高的細胞，在細胞形態(tài)、對刺激的反應(yīng)、生長速度、蛋白質(zhì)表達、傳染和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)燈方面都有改變。

l 細胞系的質(zhì)量，對實驗的成功至關(guān)重要，避免使用培養(yǎng)次數(shù)過多的細胞系也成為確保實驗可靠和可重復(fù)性的重要條件；

例：

1997年對Caco-2細胞的研究中，低傳代和高傳代的細胞相比，高傳代的Caco-2細胞的堿性磷酸酶活性顯著降低，會導(dǎo)致Caco-2細胞體外模擬小腸吸收模型的實驗數(shù)據(jù)的異常；

1997年對LNCaP細胞低和高兩種不同傳代次數(shù)的樣本檢測中，發(fā)現(xiàn)，細胞的低傳代和高傳代對雄激素，類維生素a都表現(xiàn)出不同的反應(yīng)；

傳代依賴效應(yīng)：對RAW264.7細胞的研究中，轉(zhuǎn)染細胞后，目的蛋白在高傳代細胞中的表達顯著降低；

細胞的代次

多少代次的細胞算是高傳代？

沒有明確的數(shù)量級；

細胞的特性和效應(yīng)是復(fù)雜的，嚴重依賴于許多因素，例如細胞系的類型、起源物種、培養(yǎng)條件和細胞具體應(yīng)用方向；

例如高傳代的CHO細胞可能出現(xiàn)特定蛋白表達減少；高傳代Hela細胞則可能表現(xiàn)出不同類型蛋白表達的減少；

一個細胞的“高”傳代在另一個細胞中可能并不會引發(fā)任何效應(yīng)；

結(jié)論：明確實驗?zāi)康娜ソ缍毎蔚挠绊懜雍侠?，但較低代次細胞仍然是必需品；

細胞的狀態(tài)、培養(yǎng)體系

細胞狀態(tài)不佳和細胞培養(yǎng)體系對實驗的影響：

l 細胞老化、分化與培養(yǎng)體系、培養(yǎng)環(huán)境息息相關(guān)；

l 不同細胞都有最佳的培養(yǎng)體系，培養(yǎng)體系的錯誤會導(dǎo)致細胞培養(yǎng)環(huán)境異常，從而引發(fā)細胞狀態(tài)異常、老化分化；

l 細胞傳代過程中的相關(guān)操作，傳代方式也對細胞的狀態(tài)有很大影響；

l 實驗結(jié)果的不理想不一定是細胞狀態(tài)原因，但細胞狀態(tài)甚至是形態(tài)的改變必定會導(dǎo)致細胞特性的改變，從而影響實驗結(jié)果；

l 細胞狀態(tài)和形態(tài)的變化伴隨著細胞內(nèi)DNA、RRNA甚至是細胞蛋白表達的改變，會導(dǎo)致相關(guān)實驗的失敗。

細胞的存儲：

l 就像農(nóng)民種地留種子一樣，新鮮的細胞和較低細胞代次、狀態(tài)最好的細胞需要留存下來，保證有源源不斷的種子可以用于科研實驗研究；

l 細胞凍存可以節(jié)省實驗空間、時間盒經(jīng)費，給失敗的實驗有重來的機會；

l 確保了實驗的一致性盒未來實驗的連貫性；

l 凍存體系不當(dāng)、凍存方式錯誤都會導(dǎo)致留種細胞的大量死亡，進而影響重復(fù)實驗的可靠性盒未來實驗的進程；

細胞凍存注意事項：

鏡檢觀察細胞、計數(shù)判斷細胞狀態(tài)，合適時機凍存；

細胞防凍傷：

細胞懸液中，凍存時。外部水形成冰晶，造成細胞膜盒細胞器的破壞，膜上脂質(zhì)分子破壞，造成細胞死亡；

冷凍保護劑可保護細胞免受溶質(zhì)和冰晶損傷，減少冰晶的形成（DMSO）。

凍存的“存”：

1. 冷凍保存溫度，從實際和效益的觀點出發(fā)，液態(tài)氮的低溫環(huán)境（-196℃）是目前最佳的冷凍保存溫度；

2. -70℃~-80℃保存細胞，短期內(nèi)對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低；

3. -20℃不可超過1小時，以防冰晶過大，造成細胞大量死亡。

凍存方式的演變：

1. 傳統(tǒng)的棉花包裹凍存（已淘汰）；

2. 程序降溫盒，異丙醇；

3. 程序降溫儀：針對上市生產(chǎn)的細胞株或一些脆弱的細胞，更加精準的降溫是需要的；

細胞的代次控制

1、低傳代次數(shù)與高傳代次數(shù)細胞的測試信息

2、顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查，從高低代次對比現(xiàn)測中獲得形態(tài)信息。

3、建議定期鏡檢形態(tài)并保持警惕

4、生長曲線分析：細胞的增殖實驗評估可以得出培養(yǎng)物對細胞擴增的有價值信息，增殖能力的突然增加盒減少都是細胞系可能出現(xiàn)問題的跡象。

5、建立培養(yǎng)基線、量化細胞培養(yǎng)生長是檢測培養(yǎng)的一致性和確定許多其他因素的關(guān)鍵，如傳代的最佳時間，最佳稀釋，以及在不同細胞密度下的擴增效率。

ATCC響應(yīng)的控制細胞代次的方法：

1. 嚴格遵循種子細胞庫的方法；

2. 優(yōu)化細胞環(huán)境，仔細選擇培養(yǎng)基和血清，控制PH，檢測溫度，注意細胞生長的狀態(tài)；

3. 優(yōu)化細胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)和儲存細胞的方式；

細胞培養(yǎng)其他常見問題

l 復(fù)蘇后活細胞很少或沒有；

凍存前、凍存體系、液氮滲透、操作不當(dāng)

l 解凍復(fù)蘇、傳代后細胞附著不佳；

培養(yǎng)瓶問題、消化過度、培養(yǎng)體系

l 細胞增殖、生長緩慢；

細胞高代次、培養(yǎng)體系錯誤、培養(yǎng)環(huán)境、污染、細胞傳代密度不足

l 瓶底貼壁細胞的不均勻生長

培養(yǎng)箱問題、培養(yǎng)環(huán)境、傳代不均、細胞特性